S. Caruso, V. Pavone, L. Costarella, P. Fortuna, G. Sessa
Dipartimento delle Specialità medico chirurgiche
Istituto di Clinica Ortopedica e Traumatologia
Universita’ degli Studi di Catania
Facolta’ di Medicina e Chirurgia
Direttore prof. Giuseppe Sessa

Abstract
La ricerca scientifica, parte integrante della medicina e fattore essenziale del suo progresso, ha cercato negli anni di trovare rimedi sempre più efficaci e di ottenere risultati un tempo impensabili, tali da aprire promettenti prospettive a favore della vita nascente, delle persone sofferenti e dei malati in fase acuta o terminale.
Le cellule staminali, di cui oggi si parla tanto e diffusamente, vengono considerate come frontiera, per molti versi decisiva, di una ricerca che promette grandi speranze nella terapia di gravi malattie.
Nel 2001, i risultati di alcuni studi hanno indicato che la potenzialità delle cellule staminali embrionali dell’adulto potrebbe essere più grande di quanto immaginato.
Tali cellule possono differenziarsi in linee cellulari di tessuti diversi tra loro e riprodursi. Quelle embrionali presentano la maggiore plasticità e la più elevata capacità auto-riproduttiva, esse sono state per la prima volta isolate dai topi venti anni fa e negli esseri umani treanni fa.
Nel corso degli ultimi anni si è evidenziato come le cellule staminali adulte esistono anche in tessuti diversi da sangue e cute e sono dotate di grande plasticità.
Al momento attuale i risultati più interessanti nella ricerca su cellule staminali provengono da studi su topi e molti ricercatori sono scettici circa la trasferibilità di tali risultati agli esseri umani.
Dopo aver visionato la letteratura internazionale su questo argomento, scopo del nostro lavoro è stato quello di riuscire a produrre cellule di natura osteogenetica partendo da cellule staminali di tessuto muscolare striato umano, al fine di effettuare applicazioni cliniche in campo ortopedico.
Introduzione
Per cellula staminale si intende una cellula immatura, non specializzata, ad uno stadio precoce di sviluppo, caratterizzata da due proprietà: l’auto-rinnovamento, ossia la capacità di andare incontro a processi continui di duplicazione cellulare senza mai differenziarsi verso una linea cellulare specifica e quella di dare origine a transitorie cellule progenitrici, con capacità proliferative limitate, dalle quali discendono cloni cellulari altamente differenziati.
Le cellule staminali si distinguono in base alla capacità differenziativa, che dipende dalla sede anatomica della cellula e dallo stato di sviluppo dall’organismo da cui si estraggono. Queste cellule vengono distinte in totipotenti, pluripotenti e multipotenti.
Il tessuto muscolare è un esempio di tessuto adulto dove è possibile reperire cellule staminali capaci di differenziarsi in cellule tessuto-specifiche. Il tessuto muscolare è costituito da cellule, organizzate in fibre, che hanno perso la capacità proliferativa, che viene quindi svolta da questa popolazione cellulare indifferenziata. Sono presenti due tipi
differenti di cellule staminali: le cellule “satelliti” e le “cellule staminali di derivazione muscolare” (MDSC). Entrambe le popolazioni cellulari si trovano in una fase di quiescenza del ciclo cellulare e sono capaci sia di auto-rinnovarsi, attraverso una divisione asimmetrica, che di dare origine a linee cellulari differenziate; sia le cellule satelliti che le MDSC intervengono nella fisiologica rigenerazione del muscolo.
Materiali e metodi
Il gruppo di studio del presente lavoro è costituito da otto pazienti trattati presso l’Istituto di Clinica Ortopedica di Catania.
Si tratta di pazienti di sesso maschile con età media di 25 anni.
Degli otto pazienti quattro presentavano fratture all’arto superiore (frattura diafisaria dell’omero, frattura metafisi distale radio-ulna, distacco epifisario misto, frattura capitello radiale), quattro fratture dell’arto inferiore (frattura diafisaria di tibia e perone, frattura bi-malleolare, frattura sovradiacondiloidea, frattura piatti tibiali).
Dalle sedi di frattura, in corso di trattamento chirurgico, sono state prelevate piccole quantità di tessuto muscolare.
Le biopsie prelevate sterilmente sono state poste, in ghiaccio, in Hank’s balanced soluzione (HBSS) (GIBCO) e trasferite presso il laboratorio dell’Istituto di Patologia Generale dell’Università di Catania.
Per ottenere le colture primarie bisogna attraversare due fasi: la prima consiste nella frammentazione delle biopsie tissutali in pezzetti;
la seconda consiste nella digestione enzimatica in agitazione per 1h con 0,2% di collagenesi, 0,25% di dispasi, 0,1% di tripsina, il tutto in un incubatore a 37° C al 5% di anidride carbonica e al 95% di ossigeno.
Il primo passaggio è quello di adesione e consiste nel piastrare le cellule ottenute con terreno Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) + 10%di fetal bovina serum (IBS), 10% di horse serum (HS), 1% di penicillina- streptomicina.
Dopo 1h si effettua il secondo passaggio con le cellule rimaste in sospensione e così via sino ad almeno 5 passaggi, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di cellule di analizzare.
Poi viene effettuata la semina in fiasche col terreno di coltura DMEM in incubatore a 37° C al 5% di anidride carbonica e al 95% di ossigeno.
Durante i successivi 7-14 giorni viene effettuato un controllo periodico della confluenza al Microscopio elettronico.
La confluenza si ottiene in circa 5-9 giorni.
Dopo aver ottenuto le cellule subconfluenti, si effettua l’eliminazione del terreno e i lavaggi delle cellule con PBS. Si effettua una digestione enzimatica con tripsina per 10 minuti e nuovamente si impiantano le cellule in un terreno di coltura per bloccare l’enzima dell’enzima.
Si passa, successivamente, alla caratterizzazione del fenotipo cellulare con anticorpi STRO-1, SH-2, non cross-reattivi con l’antigene CD 34 e un ultimo pennello di anticorpi costituito da CD 10, CD 90, CD 105, CD 166.
Dopo avere effettuato la caratterizzazione del fenotipo si passa alla suddivisione in fiasche (fase di espansione) per ottenere un più alto numero di cellule.
Le nuove cellule così formate vengono fatte reagire con differenziamenti:
Vitamina C, alla concentrazione di 50ng/ml, per promuovere la formazione di matrice extracellulare, la maturazione e la deposizione di tutti i tipi di collagene.
B- glicerol-fosfato, alla concentrazione di 10mM, per promuovere la mineralizzazione.
Desametasone, alla concentrazione di 40ng/ml, per promuovere il differenziamento di aumentare la calcificazione in vitro.
Vitamina D, alla concentrazione di 5ng/ml, con azione mineralizzante.
A questo punto bisogna verificare la differenziazione in senso ostiogenetico attraverso la presenza della desmina e l’attività fosfotasica alcalina.
Discussione
Le cellule differenziate risultano avere degli svantaggi, in quanto, si differenziano ad ogni passaggio per fenomeni di senescenza,hanno una limitata capacità proliferativi e sono dotate di crescita lenta che ne rende difficoltosa l’espansione.
Per ovviare a queste condizioni avverse viene usato GFs nel terreno di coltura, durante la fase di espansione e successivamente di diffusione con scaffold.
I fattori di crescita maggiormente usati in quest’ambito sono:
Insulina-like growth factors (1 e 2), che promuovono la proliferazione, la sintesi di collagene ed ECM;
Fibroblast growth, che promuovono la proliferazione, la differenziazione e la sintesi di collagene;
Trasforming growth factors beta, che promuovono la proliferazione di procurarsi ed OB, la differenziazione cellulare, la sintesi di collagene ed ECM;
Epidermal growth factors, che promuovono la proliferazione e il rimodellamento di ECM;
Vascular Endothelial growth factors, che promuovono l’angiogenesi, la vasodilatazione, la proliferazione, la migrazione delle cellule endoteliali (si usa negli scaffold per la rigenerazione ossea).
In conclusione, il processo finale, consiste nella deposizione delle cellule così trattate, in queste piastre, dette scaffold, dove, dopo aver effettuato il trattamento con i suddetti fattori di crescita, si è riusciti a produrre cellule di derivazione osteogenetica.
Le cellule maggiormente rappresentate sono osteoblasti e osteoclasti.
Al microscopio elettronico, per quanto concerne l’osteoblasto, è stato evidenziato un RER molto sviluppato,un ben evidente apparato del Golgi e numerose vescicole secretorie contenenti del materiale corrispondente alle vescicole PAS positive della microscopia ottica.
Inoltre,si sono evidenziati osteoclasti con diametro di circa 150 ?m, contenenti 50 nuclei e citoplasma acidofilo.
L’utilizzo di cellule staminali, prelevate dal tessuto muscolare, per varie patologie a carico dell’osso, pur non possedendo queste le proprietà delle cellule staminali embrionali, risulta più accessibile per la grande disponibilità di tali tessuti, senza dovere ricorrere all’isolamento in sedi, quali il midollo, che risultano essere meno fruibili e deputati ad altri usi fisiologici.
Cellule del tessuto osseo, partendo da cellule staminali muscolari, possono essere ottenute attraverso tecniche d’ingegneria genetica, che distinguiamo in tecniche “in vivo” e in “ex vivo”.Indipendentemente dalla tecnica, l’ingegneria dei tessuti richiede tre componenti: uno stimolo inducente la crescita (fattore trofico), le cellule responsive (cellule staminali), ed una struttura di sostegno, che permetta la formazione del tessuto.
Il fattore di crescita non può essere iniettato direttamente nella sede anatomica, per la sua breve emivita e per l’azione diluente esercitata da liquidi corporei. Può essere somministrato con due procedimenti: il primo consiste nell’impregnare il fattore trofico con dei polimeri, ciò richiede la conoscenza della farmacocinetica e delle caratteristiche di legame tra i due componenti; il secondo procedimento è quello di somministrare al paziente, attraverso un vettore, il gene codificante la proteina, che verrà successivamente sintetizzata.
I vettori sono divisi in virali e non virali; quelli non virali sono i liposomi, la pistola genica (gene gun), i coniugati del DNA e le matrici attivate da un gene (scaffold); i vettori virali, molto efficienti nell’infettare le cellule al fine di rilasciare il materiale genico, comprendono gli adenovirus, i retrovirus, gli herpesvirus ed i virus adeno-associati (AAV).
Il trasferimento genico effettuato mediante vettori virali viene chiamato “trasduzione”, quello mediante vettori non virali “trasfezione”; l’efficienza della trasfezione è geneticamente inferiore a quella della trasduzione.
Le cellule responsive, rappresentate dalle cellule staminali mesenchimali, sono cellule dotate di osteocompetenza e capaci di sintetizzare proteine osteogene in seguito a trasferimento genico.
Le strutture deputate alla crescita tissutale comprendono il tessuto dell’ospite (lembo di muscolo scheletrico) i polimeri di derivazione
naturale (collagene e l’acido ialuronico), i polimeri sintetici (l’acido poli-L-lattico ed acido poliglicolico), ed i polimeri sintetici iniettabili (l’alginato e l’ossido di politilene).
L’approccio in vivo consiste nell’iniettare il vettore contenente il gene, che codifica per il fattore di crescita, nel paziente; questo approccio presenta una semplicità tecnica ma è limitato dall’impossibilità di eseguire test di sicurezza in vitro sulle cellule modificate geneticamente. L’approccio in ex vivo, più complesso del precedente, consiste nell’isolare le cellule mesenchimali in vitro in seguito a una biopsia tissutale , che vengono successivamente fatte crescere e sottoposte a trasduzione; queste cellule geneticamente alterate vengono testate in vitro per accertare la riuscita del trasferimento genico e successivamente vengono introdotte nel paziente.
Le cellule staminali potrebbero esplicare la loro azione rigenerante sia se somministrate localmente a livello della patologia, sia per via parenterale. Quest’ultima proprietà è da ricondurre alla sensibilità di queste cellule di rispondere ai segnali lesivi provenienti dalle varie aree del corpo, dove ha sede la patologia, permettendo cosi una loro successiva migrazione nelle sedi appropriate.
Le cellule staminali rappresentano potenzialmente una fonte, per un approccio terapeutico, per il trattamento di diverse patologie scheletriche, sia di carattere degenerativo che traumatico.
Attraverso questa metodologia è possibile favorire la differenziazione di cellule staminali muscolari in cellule ossee, permettendo così il trattamento sia di patologie degenerative che traumatiche. Si potrebbero cosi utilizzare per il trattamento dell’osteoporosi o dell’osteogenesi imperfetta, nel favorire la sintesi di nuovi osteoblasti che possano contrastare la rarefazione dell’osso, attraverso la sintesi di nuova matrice. Inoltre queste cellule, come si è potuto evidenziare su esperimenti animali, potrebbero essere utilizzati per favorire l’artrodesi vertebrale in seguito a spondilolisi o spondilolistesi, attraverso il trasferimento nella muscolatura paravertebrale, o favorire
la guarigione di difetti di sviluppo dell’osso, localizzate, ad esempio, nella volta cranica e nelle ossa lunghe (femore e falangi).
L’uso di queste cellule potrebbe anche essere esteso ad altre strutture “non ossee” dell’apparato scheletrico: nelle articolazioni, per il trattamento di processi degenerativi (artrosi), infiammatori (artriti), e per le lesioni meniscali; nella cartilagine, interessata da difetti condrali; nei distacchi epifisari, e nelle osteocondrosi primitive, Ancora sipotrebbero utilizzare per inibire la fisiodesi che si può generare in seguito a fratture in prossimità della cartilagine di accrescimento. Negli eventi traumatici (fratture) si potrebbe, con l’utilizzo delle cellule staminali, ottenere un trattamento efficace e veloce, evitando complicanze e tempi di guarigione più o meno lunghi.
Conclusioni
Alla tendenza di ritenere auspicabile e legittima ogni tipo di ricerca e di sperimentazione, pur di ottenere i risultati sperati, e di ogni voce critica che si leva a tale proposito, come ostile alla stessa ricerca, si contrappone una questione etica di non poco conto circa il “senso”, le “finalità” e i “limiti” della sperimentazione. Non basta, cioè, che i fini della ricerca siano buoni, occorre, anche, che siano in uso mezzi tali da non compromettere i valori morali e sociali, e in generale la dignità dell’uomo, sin dalle prime fasi di sviluppo.
Questo problema troverebbe una risoluzione attraverso l’impiego di cellule staminali prelevate da tessuti adulti, così da non interessare l’embrione, soprattutto quando l’isolamento viene effettuato nello stesso soggetto dove verranno successivamente utilizzate, venendo così anche a mancare fenomeni di rigetto.
Nella speranza che il nostro lavoro sia un punto di partenza e uno stimolo in più per avviare la sperimentazione l’applicazione di cellule staminali muscolari in campo ortopedico, cosi come in altri settori specialistici, al fine di rappresentare un valido mezzo per il trattamento di svariate patologie, sia degenerative che croniche. Queste cellule in alcune malattie potrebbero rappresentare un trattamento alternativo ai trattamenti classici, soprattutto per quelle che non presentano un trattamento efficace o duraturo. Per molte altre patologie, l’utilizzo di queste cellule non sarà attuato in sostituzione dei trattamenti classici, ma in associazione.
Senza dubbio, però, del tempo dovrà passare e parecchi studi si dovranno effettuare prima di poter avere dei riscontri clinici nell’uomo.
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